MICROSCOPIA FOTÓNICA

Os principais instrumentos, ainda que não os únicos, empregues no estudo das células e dos tecidos, são os microscópios. Existem basicamente duas famílias de microscópios empregues em biologia: os microscópios fotónicos e os microscópios electrónicos.

Em biologia, a microscopia fotónica consiste num conjunto de técnicas sequenciais e complementares que visam não só a observação de células ou tecidos de seres vivos mas, também a preparação prévia desses materiais, e ainda a captura de imagens para posterior observação.

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Microscópio fotónico comum

(ou de câmara clara)

O microscópio fotónico comum, também designado por microscópio de câmara clara, é um sistema óptico capaz de fornecer, de um objecto, uma imagem ampliada, permitindo a observação de detalhes invisíveis a olho nu. É constituído basicamente por dois conjuntos de lentes: o conjunto objectiva e o conjunto ocular . A objectiva dá do objecto AB uma imagem real A'B', ampliada e invertida . A ampliação da objectiva, A_ob , é dada pela fórmula :

A_ob = A’B’/AB

A ampliação, é uma das características ópticas essenciais da objectiva. A ocular, por sua vez, fornece de A’B’ uma imagem virtual A’’B’’ muito afastada, mas que, através do cristalino, se projecta na retina do globo ocular. A ampliação da ocular é função da distância focal (f_oc ) em milímetros:

A_oc = 250/f_oc

Entre outras, destacam-se, nos microscópios, três características principais: a ampliação, a abertura numérica e o poder de resolução.

Microscópio fotónico e esquema óptico de formação de imagem

A ampliação A do microscópio é determinada a partir das ampliações da objectiva e da ocular:

A = A_ob x A_oc

Habitualmente, os microscópios vêm equipados com diversas objectivas montadas sobre um tambor rotativo (ou revolver), o que permite mudar comodamente de ampliação no decurso do trabalho. Sendo que as oculares mais comuns possuem uma ampliação de 10x e a objectiva de maior ampliação, é de 100x, a ampliação máxima habitual do microscópio fotónico raramente ultrapassa o limiar útil de 1000x .

 A abertura numérica AN da objectiva é dada pela fórmula:

AN = n. sen a

sendo n o índice de refracção do meio que se interpõe entre o objecto AB e a lente e a , o ângulo que forma o raio mais externo captado pela lente frontal da objectiva.

Habitualmente, o meio em contacto com a lente é o ar (n = 1). Porém, se se substituir o ar por um líquido cujo índice de refracção seja superior, pode obter-se um valor superior para a abertura numérica. Na prática, obtém-se este efeito imergindo a objectiva numa gota de óleo (óleo de imersão) cujo índice de refracção é de 1,51. As melhores objectivas de imersão possuem uma abertura numérica que atinge 1,4 .

O poder de resolução é a capacidade que o microscópio possui de distinguir dois pontos adjacentes. Na prática, o poder de resolução é expresso pelo limite de resolução e, que é a menor distância que pode existir entre dois pontos para que apareçam individualizados. Em consequência, quanto menor for o limite de resolução da objectiva, maior será o respectivo poder de resolução.

Aberturas das objectivas

O limite de resolução é função da AN e do comprimento de onda médio da luz l empregue na observação. Assim, e dado pela

fórmula:

e = 0,61 l l n. sen a

Sendo a luz amarelo esverdeada (l = 570 nm) aquela para a qual o olho possui maior sensibilidade, e empregando uma objectiva de imersão, atinge-se um limite de resolução de 250 nm (e = 0,61 x 570 / 1,4 = 250 ).

Pode ainda reduzir-se este limite, empregando uma iluminação ultravioleta, de comprimento de onda de 275 nm. As objectivas corrigidas para este comprimento de onda possuem todavia uma abertura numérica ligeiramente mais fraca (1,25); nestas condições, o limite de resolução diminui e baixa a 130 nm. Contudo, a imagem não podendo ser observada directamente, é projectada numa emulsão fotográfica.

Do que foi dito se deduz que o poder de resolução de um microscópio lhe é conferido exclusivamente pela objectiva. A ocular não pode acrescentar detalhes à imagem; a sua função é apenas aumentar a dimensão da imagem produzida pela objectiva.

Os microscópios fotónicos empregues em biologia permitem a observação de objectos transparentes. A iluminação da preparação microscópica é obtida a partir de uma fonte de luz e através de um sistema óptico designado por condensador, cuja abertura numérica é superior à da objectiva e que actua condensando os raios luminosos provenientes da fonte.

Microscopio de contraste de fase

O microscópio de contraste de fase é uma variante do microscópio fotónico, dotado de um sistema óptico especial que transforma diferenças de fase dos raios luminosos em diferenças de intensidade. Deste modo, acentuando pequenas diferenças de índice de refracção e de espessura existentes entre vários componentes celulares, o microscópio de contraste de fase possibilita o estudo de materiais vivos e não corados.

Este microscópio baseia-se no princípio de que a densidade de um corpo determina a velocidade com que a luz o atravessa e, consequentemente, o seu índice de refracção. Quando uma partícula transparente, cujo índice de refracção é próximo do meio envolvente, é atravessada por um raio luminoso, uma parte do raio atravessa sem se desviar (onda S), enquanto que outra parte se difracta e desvia (onda D). Nas preparações biológicas, a diferença de fase entre as ondas S e D é de ¼ l, aproximadamente.

No microscópio de contraste de fase, o raio mais lateral que passa através da objectiva é adiantado de ¼ l em relação à luz central, pela introdução de uma placa anelar na objectiva. Também no condensador se introduz um diafragma anelar. A placa anelar é um disco transparente com um sulco em forma de anel, que coincide com a imagem directa do condensador. O efeito de fase decorre da interferência entre a imagem geométrica fornecida pela parte central da objectiva e a imagem difractada, dada pelos raios laterais, adiantada de ¼ l .

Esquema de funcionamento do microscópio de contraste de fase

Essas diferenças, transformadas em diferenças de intensidade, traduzem-se por imagens luminosas às quais a retina é sensível. O microscópio de contraste de fase é utilizado sobretudo para observar células vivas, nomeadamente células cultivadas.

Paramécia viva observada em contraste de fase

Microscópio de fluorescência

O microscópio de fluorescência permite estudar os constituintes celulares que manifestem autofluorescência, como por exemplo o caroteno, ou fluorescência secundária a eles transmitida por corantes especiais (fluorocromos). Denomina-se fluorescência a propriedade de certas substâncias que, ao serem excitadas por uma luz de comprimento de onda curto, emitirem luz de um comprimento de onda maior. Emprega-se para tanto luz ultravioleta de comprimento de onda inferior a 350 nm, de forma a obterem-se radiações emitidas na gama de 400 a 700 nm, isto é, dentro do espectro da luz visível.

É com recurso a esta técnica que se evidenciam, por exemplo, os antigenes quando associados a anticorpos acoplados a moléculas fluorescentes.

Ainda que em princípio qualquer microscópio possa ser adaptado para trabalhar em fluorescência, os melhores resultados obtêm-se com microscópios especialmente concebidos para este fim, nos quais as ópticas de vidro são substituídas por lentes de quartzo, a fonte luminosa consiste numa lâmpada de vapor de mercúrio e, antes da ocular, se insere um filtro protector, para remover as radiações ultravioletas, indesejáveis pelos danos que poderiam causar aos olhos do observador.

Microscópios estereoscópicos

Os microscópios estereoscópicos são habitualmente designados por lupas binoculares. Contrariamente aos outros, estes não se encontram limitados a observar por transparência, não sendo todavia excluído que o possam fazer. Recebem a luz reflectida pelo objecto e atingem geralmente ampliações da ordem de 30 x.

Microscópio estereoscópico (lupa binocular)

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