MICROSCOPIA ELECTRÓNICA
A diferença básica entre as duas modalidades de microscopia, consiste no facto de na primeira, a imagem ser produzida por fotões e na segunda, por electrões. Daí decorrem necessariamente, consequências, quer a nível de concepção física dos aparelhos, quer a nível da preparação do material, quer a nível da natureza da imagem e ou ainda da performance da técnica.
Microscópio electrónico de transmissão
(Transmission electron microscope)
O microscópio electrónico de transmissão é habitualmente designado abreviadamente pelas iniciais doseu nome em inglês: TEM. Desenvolveu-se nos anos 30. Os primeiros cientístas a utilizá-lo em Biologia, foram Albert Claude, Keith Porter e George Palade, nos anos 40 e 50.
Tal como no microscópio fotónico, também no microscópio electrónico é composto por uma fonte (de electrões), um sistema ocular, um sistema objectiva e um sistema condensador. Estes sistemas são constituídos por lentes (bobinas) electromagnéticas que actuam sobre o feixe de electrões, reproduzindo a maior parte dos sistemas ópticos clássicos: lentes convergentes, lentes divergentes, espelhos, prismas, etc.
A fonte consiste num filamento metálico tornado incandescente pelo efeito de Joule. Este encontra-se inserido num campo eléctrico em que os electrões emitidos pelo filamento são atraídos para um alvo. A atracção é gerada pela diferença de potencial (50 a 100 KV) criada entre o próprio filamento, que neste contexto desempenha o papel de cátodo, e o alvo (ânodo). Tal facto tem como consequência que os electrões se deslocam a uma elevada velocidade. Nada porém aconteceria se o alvo não fosse perfurado centralmente (écran perfurado). Os electrões que passam através deste orifício, constituem um feixe apertado mas de tendência divergente. Este feixe é condensado pela lente condensadora e incide sobre a preparação a ser examinada (espécime).
Ao atravessar a preparação, os electrões são desviados uns mais do que outros. O feixe de electrões com os desvios introduzidos pela preparação, é dispersado pela lente objectiva. Parte desse feixe é, por sua vez, dispersado por outro campo magnético que age como lente de projecção.
Não sendo a nossa visão sensível aos electrões, a imagem é projectada sobre um écran fosforescente de Sulfureto de Zinco. Neste, os pontos onde embate um electrão, emitem fotões. Consequentemente, podemos ver a imagem, indirectamente, através da “descodificação” realizada pela matéria fluorescente do écran. A mesma imagem pode ser projectada sobre uma película fotográfica ou ainda captada por um sistema de vídeo e posteriormente digitalizada por um computador.
No objecto a observar, as zonas mais densas aos electrões, que induzem consequentemente maiores desvios ou mesmo absorção, aparecerão menos luminosas no écran. Pelo contrário, as zonas menos densas, darão origem a imagens mais brilhantes no écran; portanto escuras no negativo e claras no positivo fotográfico. Assim, podemos dizer que a imagem que observamos é a sombra electrónica do objecto.
Contrariamente aos fotões, os electrões não podem chocar com quaisquer átomos ou moléculas. Por esta razão, o interior do microscópio electrónico encontra-se em vazio quase absoluto. Facto que inviabiliza a observação de seres vivos.
Trajecto dos electrões (em amarelo) no microscópio electrónico de transmissão
Tal como para o microscópio fotónico, também neste caso se coloca a questão do poder de resolução. Deve-se a Louis de Broglie a descoberta de que aos electrões, se encontra associada a propagação de uma onda, cujo comprimento de onda é dado pela fórmula:
l = h / mv
em que h é a constante de Plank (h = 6,62 x 10-27 no sistema de unidades C.G.S), m é a massa do electrão e v, a sua velocidade. Por exemplo, os electrões acelerados por uma diferença de potencial de 75 KV, adquirem a velocidade de 145.000 Km/s e o seu comprimento da onda associada é l = 0,043 nm. Este valor é 100.000 vezes inferior ao comprimento de onda das radiações azul-violeta, que correspondem ao máximo de sensibilidade das emulsões fotográficas (l= 4300 nm).
Este facto aponta para a possibilidade teórica de se atingirem, com os microscópios electrónicos, resoluções da ordem de 0,002 nm. Todavia, como o poder de resolução depende não só do comprimento de onda mas também da abertura numérica, e esta ser limitada por razões inerentes a natureza electromagnética das lentes, atingem-se limites de resolução próximos de 0,1 nm. Todavia, na observação de espécimes biológicos, pela falta de contraste que os caracteriza, raramente se consegue ultrapassar a resolução de 1-2 nm.
O desenvolvimento do microscópio electrónico possibilita-nos ampliações de 100.000 x ou mesmo mais.
Preparação dos espécimes
Visto que o princípio deste microscópio é a observação de espécimes transparentes, estes devem apresentar-se extremamente delgados. Para o efeito, o material biológico sofre uma preparação específica que compreende as seguintes etapas: fixação, corte, deposição em grelhas, contrastação.
Fixação
A fixação, como para a microscopia fotónica, é um processo através do qual se procura preservar as estruturas celulares. Neste caso, porém, é necessário ter ainda em conta que as estruturas celulares deverão ser preparadas para resistirem com um mínimo de distorções, às condições de observação totalmente secas, como são aquelas que vigoram no interior do microscópio. Empregam-se para tal dois compostos: o glutaraldeido, que consolida as estruturas proteicas, estabelecendo com elas ligações covalentes; o tetróxido de ósmio que estabiliza as bicamadas lipídicas e também as estruturas proteicas.
Inclusão e Corte
Porque os electrões têm um poder de penetração extremamente fraco, os objectos devem ser cortados em fatias muito finas, da ordem de 50 a 100 nm de espessura. Designam-se por cortes ultra-finos. Para se conseguir obter cortes tão delgados, os tecidos são embebidos (inclusão) em resinas que polimerizam sob a forma de um bloco de plástico. Os cortes são depois efectuados com recurso a facas de vidro ou de diamante.
O aparelho que se emprega para esta função designa-se por ultra-micrótomo. O seu funcionamento é semelhante ao do micrótomo rotativo descrito no capítulo relativo à microscopia fotónica, com a diferença que o avanço do braço porta objecto não resulta de um processo mecânico, mas da dilatação de uma barra metálica.
Os cortes são depositados em grelhas de cobre de 3 mm de diâmetro.
UUltramicrótomo e pormenor da operação de corte
Contrastação
Sabemos que o contraste obtido no microscópio electrónico depende do número atómico dos átomos que compõem o espécime: quanto maior for o número atómico, maior será a probabilidade de o electrão ser retido e, portanto, maior o contraste. As moléculas biológicas são compostas por átomos com números atómcos muito baixos. Para aumentar o contraste, os cortes são submetidos a oluções de sais pesados, tais como o urânio ou o chumbo. Para este fim, emprega-se correntemente o acetato de uranilo e o citrato de chumbo.
Microscópio electrónico
de varrimento
(Scanning electron microscope)
O microscópio electrónico de varrimento designa-se habitualmente pela abreviatura do seu nome em inglês: SEM. Emprega igualmente um feixe de electrões, mas estes, em vez de atravessarem o espécime, colidem com a superfície deste, previamnete metalizada, e libertam electrões secundários. É a partir destes electrões, que se obtem uma imagem num monitor de vídeo. O feixe de electões primários é móvel e varre a superfície do espécime. Daí obter-se uma imagem completa da superfície do objecto a observar.
O Poder de resolução dos SEM é da ordem dos 10 nm, e a ampliação atinge valores da ordem de 20.000x.
Trajecto dos electrões no microscópio electrónico de varrimento
A preparação do material para ser observado em SEM compreende duas etapas principais: a deshidratação e a metalização.
Esta última consiste na deposição de uma fina camada de um metal, empregando-se geralmente o ouro. Para tal, o metal é aquecido sob vazio e, ao vaporizar-se, deposita-se sobre o espécime.
Microscópio electrónico de varrimento
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