HISTOLOGIA E HISTOQUÍMICA
A correcta observação do material biológico, em microscopia fotónica, implica uma série de procedimentos técnicos prévios, que a seguir se descrevem sumariamente. Estes procedimentos, designam-se genericamemte por técnicas histológicas:
Fixação
As células dos órgãos e tecidos, pouco depois de morrerem, decompõem-se rapidamente. O processo de fixação destina-se a preservar as células, evitando as modificações post mortem conhecidas por autólise e conservando, deste modo, a estrutura morfológica. Consiste basicamente na estabilização da estrutura das proteínas, por coagulação. Entre os muitos agentes fixadores que se empregam, destacam-se o álcool etílico, o ácido acético, o formol e o ácido pícrico.
Inclusão e corte
Os organismos unicelulares e as células isoladas podem observar-se, com facilidade, ao microscópio. Pelo contrário, os órgão ou tecidos, mesmo cortados em pequenos pedaços, não são suficientemente transparentes para poderem ser observáveis. É necessário então cortá-los em lâminas tão delgadas quanto possível, por forma a serem transparentes aos fotões. Tratando-se de materiais geralmente moles, esta operação só é possível senão após um tratamento de impregnação numa substância plástica dura. A mais amplamente empregue é a parafina. Fundida a temperatura relativamente elevada (50 a 60º C) a parafina penetra profundamente nos tecidos e, uma vez arrefecida, solidifica e permite a realização de cortes finos de 3 a 10 mm de espessura. A operação de corte é efectuada com o auxílio de um instrumento designado por micrótomo, que dispõe de uma faca de aço. Os cortes assim obtidos são dispostos em lâminas de vidro (lâminas de microscópio).
Micrótomo (tipo “rotativo”) e operação de corte
Coloração
A maioria dos elementos que constituem os tecidos é naturalmente incolor e os respectivos índices de refracção não se afastam muito do da água. Para que eles se tornem visíveis ao microscópio fotónico, recorre-se à coloração quer dos componentes proteicos das estruturas, quer das inclusões celulares de natureza química diversa. Alguns dos corantes mais comuns são a hematoxilina, a floxina e o verde luz. Mas há muitos mais.
Montagem
Esta última operação consiste em fechar o material entre a própria lâmina que suporta o espécime e uma lamela de vidro. A lamela é colocada sobre o material com o auxílio de uma resina solidificável, que serve simultaneamente para aumentar a transparência dos cortes e conservá-los. Emprega-se tradicionalmente como resina, o bálsamo-do-canadá, cujo índice de refracção ao secar ( n = 1,535) é próximo ao do vidro em que é feita a lamela.
O problema decorrente da fraca diferença de contraste entre as estruturas biológicas e o meio em que se observam pode ser solucionado através de outras técnicas que excluem a coloração, graças ao emprego de microscópios da mesma família do microscópio fotónico comum, mas que tiram partido de outras leis físicas.
A histoquímica é uma técnica histológica que tem por objectivo a identificação da natureza química de constituintes celulares. Consiste na coloração específica desses constituintes, recorrendo basicamente a substâncias que, reagindo com os componentes celulares, dão origem a produtos corados. Esta técnica contrasta com a coloração histológica comum, acima referida, na medida em que esta última se baseia na absorção, pelas estruturas, de substâncias coradas (os corantes), enquanto que na histoquímica, as cores são propriedade de produtos que se formam in sito.
Um dos exemplos clássicos é o método de Feulgen que se destina a identificar o DNA. O princípio da reacção baseia-se no facto de que o DNA, após hidrólise ácida moderada, quando tratado pelo reagente de Schiff , dar lugar à formação de um produto que se cora em vermelho arroxeado.
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