FRACCIONAMENTO
CELULAR
O fraccionamento celularconsiste na separação, por centrifugação, das estruturas sub-celulares, após rompimento das células.
As células podem ser rompidas de várias maneiras, sendo a técnica mais comum, o emprego um pilão plástico rotativo dentro de um tubo. O espaço entre o pilão e a parede do tubo deve ser suficiente para romper as células provocando um mínimo de danos nos organitos. Os fragmentos de retículo endoplasmático unem-se e formam vesículas isoláveis, os microssomas. Utilizando porções de tecido ou células em cultura, obtém-se uma suspensão homogeneizada. É essa suspensão que será sujeita a centrifugação.
Fraccionamento
por centrifugação diferencial
O comportamento de uma partícula num campo de centrifugação depende essencialmente do seu peso e da resistência que encontra no meio de suspensão . Assim sendo, tamanho, densidade e forma influenciam o comportamento de uma partícula num campo de centrifugação. O método mais amplamente utilizado para separar organitos celulares, é a centrifugação diferencial. Baseia-se nas diferenças de velocidade com que as partículas sedimentam no fundo de um tubo de centrifugação. Sujeitas a uma determinada força de centrifugação, as estruturas relativamente grandes, densas e pesadas, sedimentam mais rapidamente.
Assim, usando-se forças e durações de centrifugação crescentes, e retirando de cada vez, o sedimento que se concentra no fundo do tubo, ou “pellet”, será possível obter suspensões de núcleos, depois de mitocôndrias, lisossomas e peroxissomas, depois separam-se os pequenos microssomas, depois ainda, os ribossomas livres. A fracção sobrante, despojada quase totalmente de estruturas, é o citossol.
Fraccionamento por centrifugação em
gradiente de densidades
Como se viu, a centrifugação diferencial não permite separar as mitocôndrias dos lisossomas e dos peroxissomas. Estes três organitos sedimentam conjuntamente, se bem que tenham densidades diferentes.
Nestes casos, emprega-se a técnica de fraccionamento em gradiente de densidades. Consiste em sujeitar uma suspensão de partículas com diferentes densidades, a uma força centrífuga constante, mas num meio de densidade gradualmente variável, de uma extremidade à outra do tubo. Empregam-se diversas substâncias para criar, num tubo de centrifugação, um gradiente de densidades; a mais comum é a sacarose.
Nestas condições, partículas com densidades diferentes, deslocar-se-ão no campo de forças e situar-se-ão em níveis de densidade da solução que igualem a sua própria densidade. Deste modo, é possível separar organitos como as mitocôndrias, os lisossomas e os peroxissomas.
As fracções isoladas podem, posteriormente, ser submetidas a uma gama diversificada de análises bioquímicas, para se identificar a composição química, a actividade enzimática, bem como as capacidades metabólicas. Mas podem também ser igualmente encaminhadas para observação em microscopia electrónica.
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