Ferramentas genéticas aplicadas em animais modelo
Variação natural
Coleções de mutantes
JAX Lab.
Um exemplo com dismorfologias craniofaciais e correspondente protocolo de avaliação.
Mutagénese
Ao acaso
Direcionada
Geralmente transgénicos.
Genes reporter
Controlados por promotores, para revelarem o respetivo padrão de expressão.
- Promotor em cis; por exemplo linhas enhancer trap. Ver contextualização desta tecnologia no estudo da regulação genética em stem cells embrionárias.
- Promotor em trans: sistemas driver-responder e um exemplo de aplicação.
Caso especial: sistema yeast two-hybrid (levedura) para determinação de interações entre proteínas (interactoma, vide abaixo). O sistema Halotag (baseado em colunas com ligação covalente e proteases TEV) é o "novo grito" porque reduz os falsos positivos.
Inativação dum locus por deleção parcial ou total
Também inclui opções de substituição alélica.
- Knock-out (K.O.) por recombinação homóloga apresentação do DNA Learning Center, fact sheet do NHGRI, ou esta revisão (Current Protocols in Cell Biology). Catálogo de mutantes mantido pelo International Mouse Phenotyping Consortium
- Linhas floxed, com a recombinase Cre controlada por um promotor driver (vídeo do Jackson Laboratory; drivers; número especial da Genesis). O JAX disponibiliza um portal com listas de estirpes portadoras do gene da recombinase Cre (incluindo a Cre como gene reporter) e estirpes floxed.
- Genome editing com nucleases: fundidas com domínios Zinc finger (ZFN), módulos ('Lego') das Transcription Activator-Like Effector Nucleases (TALENs) ou guiadas por RNAs (nomeadamente a proteína 9 associada a um CRISPR — Clustered Regularly Spaced Short Palindromic Repeat — Cas9; uma revisão aborda o potencial de aperfeiçoamento do CRISPR-Cas9) e o portal da RTH dá acesso a uma ferramenta de previsão de eventos off-target; ver revisão cobrindo as três ferramentas. Vídeo de 2017 sobre as diversas aplicações da CRISPR-Cas9.
A opção CRISPR-Cas9 é especialmente adequada para uma opção de conversão alélica, usando uma sequência dadora, ou seja: em vez de inativação, substituição dum alelo por outro (como na recombinação homóloga, mas geralmente com a intenção de ficar uma versão funcional). Exemplo de mutações hipomórficas geradas com CRISPR-Cas9. Descarregar o manual da invitrogen (2018). Ver vídeo da benchling sobre o desenho de gRNAs. Visitar ainda Resources for the design of CRISPR gene editing experiments, o portal WeReview que compara as diversas ferramentas de design experimental envolvendo CRISPR-Cas, ou ainda o portal Gene editing da Horizon, a criadora do CRISPRi, para knockdown.
Loci humanizados
A primeira abordagem foi com imunoglobulinas já em 1991, mas com aplicação alargada a partir de exemplos mais recentes: metodologia (e respetiva verificação). Ver a coleção produzida pela Biocytogen, ou ainda os da Genoway, incluindo de genes GPCR, e mais explícita sobre os fins de cada tipo de humanização. Estratégia semelhante usada para os genes de citocromos P-450.
Genomas completos
Incluindo o da própria espécie humana.
Populações
Organoides
Ver esta revisão e a brochura da Sartorius. Os exemplos são muito diversos: mini-encéfalos, modelos de cancro do pâncreas, recuperação duma componente epitelial