Engenharia Genética
Clonagem de DNAs em Bactérias
(Módulo I)
Acção Foco CCPFC/ACC-9835/98
(Programa Prático)
Carlos Sinogas, Luís Alho, Isabel Brito, 1998
SUMÁRIO
OBJECTIVO
*
CULTURA DE BACTÉRIAS em meio líquido
*
Preparação de meios Sólidos
*
Extracção e Purificação de DNAs
*
MINIPREP
ARAÇÃO DE DNA PLASMÍDICO *
quantificação de DNAs
*
RESTRIÇÃO Enzimática
*
Separação Electroforética
*
purificação de fragmentos de DNA (agarose "low melting")
*
Material Biológico
*
pCS11
* / pCS62 * / pCS71 * / pCS84 * / pSK+ *
Notas
*
OBJECTIVO
Familiarização dos formandos com técnicas base de Biologia Molecular para a manipulação de ácidos nucleicos e sua clonagem em vectores e hospedeiros procarióticos
Preparação de um fragmento de DNA a ser inserido em bactéria E.coli (módulo II)
Material Biológico
Bactérias transformadas com plasmídio vector (pSK+) e com plasmídios recombinantes (pCS11, pCS62, pCS71, pCS84)
CULTURA DE BACTÉRIAS em meio líquido
Reagentes
LB 10X:
Bacto-triptona 100 g
Extracto de levedura 50 g
NaCl 100 g
H2O destilada até 1000 ml
pH 7,5. Autoclavar. Conservar estéril a 4°C.
Ampicilina 1000X:
50 mg/ml em água. Esterilizar por filtração, conservar a -20°C.
Água destilada e esterilizada
Protocolo Experimental
Preparar assepticamente 50 ml de meio LB 1X com água estéril (45 ml de água + 5 ml de LB 10X).
Adicionar 50 m l de ampicilina 1000X (50 m g/ml).
Inocular com bactéria contendo o plasmídio a preparar.
Incubar 37°C durante uma noite sob agitação.
Preparação de meios Sólidos
Reagentes
LB 10X
Ampicilina 1000X
Água destilada e esterilizada
Agar agar (Difco 80-120 Mesh)
Protocolo Experimental
Agar 2X
- Pesar 3,0 g de agar para fraco rolhado autoclavável de 250 ml
- Adicionar 100 ml de H2O destilada
- Aquecer a 100ºC até completa dissolução do Agar
- Autoclavar a 121ºC durante 15 minutos
- Deixar arrefecer e fechar bem os frascos. Conservar estéril.
Agar - LB/amp
- Preparar assepticamente 100 ml de LB 2X (20 ml LB 10X + 80 ml H2O)
- Adicionar ampicilina 1000X (200 µl) se necessário
- Aquecer a cerca de 50ºC em banho-maria
- Fundir Agar 2X em forno microondas (não usar potência máxima e afrouxar ligeiramente a rolha do frasco)
- Adicionar ao frasco com Agar 2X fundido (100 ml), os 100 ml de LB 2X
- Homogeneizar evitando a formação de bolhas de ar
- Colocar em banho-maria a 45ºC até utilização
Placas de Petri
- Sem abrir totalmente a placa, verter cerca de 20 ml de meio a uma temperatura de 45ºC, tapando a placa de imediato
- Após a solidificação inverter as placas
- Conservar em frigorífico
Tubos para Stabs
- Pipetar assepticamente cerca de 1,5 ml de meio LB sólido para tubos roscados de 2 ml.
- Rolhar sem apertar completamente.
- Deixar solidificar o meio com os stabs ligeiramente inclinados
- Após solidificação, apertar bem a tampa dos tubos.
- Conservar em frigorífico
Extracção e Purificação de DNAs
Reagentes
LB 1X com ampicilina.
Lisozima (pó)
Isopropanol
5 M NaCl
Etanol puro e 70 %
TE pH 8,0:
- 10 mM Tris-HCl pH 8,0
- 1 mM EDTA
Pronase 20 mg/ml em água (auto-digerida durante 2 horas a 37°C. Conservar a -20ºC)
Pronase Mix:
- Pronase 50 µl
- 10 % SDS 86 µl
- H2O 860 µl
RNAse A 10 mg/ml em:
- 10 mM Tris-HCl pH 7,5
- 15 mM NaCl
- (incubada por 15 minutos a 100°C e arrefecimento lento. Conservar a -20ºC)
RNAse mix:
- RNAse A 40 µl
- TE pH 8,0 10 ml
Solução I:
- 25 mM Tris-HCl pH 8,0
- 50 mM Glucose
- 10 mM EDTA
Solução II:
Solução III:
- 5 M KOAc 60 ml
- Ac.acético glacial 11,5 ml
- H2O destilada 28,5 ml
- pH 4,8
Fenol:clorofórmio:
- Fenol destilado 50 ml
- Clorofórmio 50 ml
- Álcool isoamílico 1 ml
- 8-hidroxiquinoleína 0,1 g
- TE pH 8,0 15 ml
- (usar apenas a fase orgânica, de cor amarela, não agitar)
Protocolo Experimental
- Usar 50 ml de cultura saturada de bactéria recombinante.
- Centrifugar 4.000 X G durante 15 minutos a 4°C.
- Lavar o sedimento de bactérias com 5 ml de LB. Decantar e escorrer completamente o sobrenadante.
- Ressuspender bem o sedimento com 2 ml de Solução I.
- Adicionar 10 mg de lisozima. Misturar. Repousar 10 minutos à temperatura ambiente.
- Adicionar 4 ml de Solução II. Misturar por inversão. Repousar 10 minutos no gelo.
- Adicionar 3 ml de Solução III. Misturar. Repousar 10 minutos no gelo.
- Centrifugar 7.000 X G durante 30 minutos a 4°C.
- Filtrar o sobrenadante por gaze hidrófila.
- Adicionar 0,6 volumes de isopropanol. Repousar 10 minutos à temperatura ambiente.
- Centrifugar 7.000 X G durante 30 minutos. Decantar.
- Lavar o precipitado com etanol a 70 %.
- Lavar o precipitado com etanol a 96 %. Secar o precipitado.
- Dissolver com 500 m l de RNAse-mix.
- Incubar a 37°C durante 60 minutos.
- Adicionar 100 m l de Pronase-mix.
- Incubar a 37°C durante 30 minutos.
- Extrair 2 vezes com fenol:clorofórmio (igual volume).
- Tomar a fase aquosa, sem interfase.
- Adicionar 0,04 v. de 5 M NaCl (24 m l) e 2 v. de etanol puro (1,2 ml).
- Precipitar durante a noite a -20ºC.
- Recuperar DNA plasmídico por centrifugação (7.000 X G durante 30 minutos).
- Dissolver com 50 m l de TE pH 8,0.
- Avaliar a concentração de uma alíquota por leitura da DO a 260 nm
(50 µg/ml = 1 UDO)
MINIPREP
ARAÇÃO DE DNA PLASMÍDICO
Reagentes
(mesmos da Preparação de DNA Plasmídico)
Protocolo Experimental
- Inocular 5 ml de LB com cada colónia a analisar.
- Incubar a 37ºC durante uma noite com agitação.
- Pipetar 1,5 a 2 ml de suspensão para microtubo.
- Centrifugar 1 minuto na microcentrífuga.
- Decantar e escorrer completamente o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento com 100
m l de Solução I. Misturar.
Adicionar 200 m l de Solução II. Misturar por inversão. Agitar.
Repousar 10 minutos no gelo.
Adicionar 150 m l de Solução III. Misturar.
Agitar fortemente à mão para partir DNA cromossomal.
Centrifugar 5 minutos na microcentrífuga.
Pipetar 400 m l de sobrenadante límpido.
Adicionar 250 m l de isopropanol. Repousar 10 minutos à temperatura ambiente.
Centrifugar 20 minutos na microcentrífuga.
Decantar
Lavar o precipitado com etanol puro.
Centrifugar 5 minutos na microcentrífuga.
Decantar, escorrer e secar.
Dissolver com 50 m l de RNAse-mix.
Incubar a 37°C durante 30 minutos.
Usar 10 m l para digestão com enzima de restrição.
Quantificação de DNAs
Reagentes
Solução padrão de DNA (0,5 mg /ml)
Solução de DNA a quantificar
Parafilm
TE/BrEt: TE pH 8.0 contendo Brometo de etídio a 0,5 µg/ml
Protocolo Experimental
- Preparar 6 diluições decimais do DNA padrão:
|
Tubo |
TE/BrEt |
DNA |
Concentração |
|
Amostra |
Volume |
|
1 |
45 µl |
Padrão |
5 µl |
50 µg / ml |
|
2 |
45 µl |
Tubo 1 |
5 µl |
5 µg / ml |
|
3 |
45 µl |
Tubo 2 |
5 µl |
500 ng / ml |
|
4 |
45 µl |
Tubo 3 |
5 µl |
50 ng / ml |
|
5 |
45 µl |
Tubo 4 |
5 µl |
5 ng / ml |
|
6 |
50 µl |
- |
- |
0 |
- Diluir amostra de DNA a quantificar a 1:10 com TE/BrEt
- Distribuir I gota de cada diluição do padrão, em fila, sobre parafilm
- Aplicar I gota idêntica da diluição do DNA a quantificar
- Observar sob luz UV
- Comparar as intensidades de fluorescência relativas
RESTRIÇÃO Enzimática
Reagentes
Solução de DNA a analisar
Enzimas de restrição:
- Bam HI (10 U / µl)
- Eco RI (20 U / µl)
- Sal I (20 U / µl)
Fenol:clorofórmio
Tampão Universal (Stratagene) 10X (TUS 10X):
- 1M KOAc
- 250 mM Tris-Acetato pH 7,6
- 100 mM MgOAc
- 5 mM b -Mercaptoetanol
- 100 m g/ml BSA
Protocolo Experimental
- Em microtubo, adicionar sequencialmente:
- H2O estéril 19,25 µl (ou q.b.p. 25 µl final)
- Solução de DNA 1 µl (1 µg)
- TUS 10X 3,75 µl (1,5 X final)
- Solução de enzima 1 µl (10 Unidades)
- Misturar no vortex.
- Centrifugar brevemente para levar tudo para o fundo do tubo.
- Incubar a 37°C durante 1 hora.
- Desproteinizar pelo fenol:clorofórmio:
- Adicionar 25 µl de fenol:clorofórmio. Misturar bem.
- Centrifugar 1 minuto na microcentrífuga.
- Pipetar fase aquosa para novo tubo.
- Tomar 10 µl para análise em gel.
Separação Electroforética
Reagentes
TBE 10X
- 890 mM Tris
- 890 mM Ácido bórico
- 20 mM EDTA
- pH 8,0
Agarose média ou baixa EEO (Sigma Tipo II ou V)
Brometo de etídio 10 mg/ml
Dye-DNAs (Indicador de Migração):
- 25 % Ficoll 400
- 0,25 % Orange G
DNA marcador:
Protocolo Experimental
- Fundir a agarose (0,7%) em 95 % volume final de água.
- Arrefecer a cerca de 50°C.
- Adicionar 5 % de TBE 10X (0,5 X final).
- Adicionar 0,005 % Brometo de etídio (0,5 µg/ml final).
- Misturar e verter no molde.
- Colocar o pente e deixar solidificar.
- Colocar o gel no aparelho, submerso em TBE 0,5X.
- Aplicar as amostras de DNA, contendo 10 a 20% de Dye-DNAs.
- Aplicar uma amostra de DNA marcador (0,5 a 1 µg)
- Proceder à separação electroforética (75 V), até conveniente migração.
- Visualizar sob luz UV (
l = 300 a 320 nm).
Fotografar o gel com filtro vermelho de gelatina.
Purificação de fragmentos de DNA (agarose "low melting")
Reagentes
Fragmento de DNA a purificar
Fenol:clorofórmio
Lâmina de barbear, passada por álcool
TAE 10X
- Tris base (400 mM) 48.44 g
- Acetato (400 mM) 11.42 ml (ac.acét.)
- EDTA (10 mM) 3.72 g
(mw=372.24)
- H2O q.b. 1000 ml
Protocolo Experimental
- Isolar o DNA em gel de agarose "low melting" em TAE 1 X
- Aquecer TE pH 8.0 em banho-maria equilibrado a 67ºC
- Visualizar rapidamente sob luz UV (l = 300 a 320 nm) e localizar o fragmento de DNA a purificar. Excisar, com lâmina de barbear, a agarose mínima contendo o DNA a purificar. Eliminar excesso de agarose não fluorescente
- Transferir para tubo eppendorf (volume inferior a 200 µl por tubo)
- Fundir a agarose no banho-maria (cerca de 10 minutos)
- Adicionar TE a 67ºC até uma concentração de agarose inferior a 0,5%.
- Passar à temperatura ambiente
- Extrair com fenol:clorofórmio (15 segundos em vortex, centrifugar durante 3 minutos, recuperar a fase aquosa para novo tubo)
- Re-extrair com fenol:clorofórmio
- Re-extrair só com clorofórmio
- Arrefecer a fase aquosa em gelo durante 15 minutos
- Centrifugar durante 15 minutos
- Recuperar o sobrenadante límpido
- Precipitar com etanol
Material Biológico
pCS11
pCS62
pCS71
pCS84
pSK+
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