[Universidade de Evora]

UNIVERSIDADE DE ÉVORA

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR

Responsável: Prof. Carlos Sinogas

UNESUL - Parque Industrial de Évora
Rua da Barbarrala, 1 - 7000 ÉVORA

Tel./Fax: 266 750 617 / 8
Email:
labbiom@uevora.pt

 

Engenharia Genética
Clonagem de DNAs em Bactérias

(Módulo I)

Acção Foco CCPFC/ACC-9835/98

 

 

(Programa Prático)

Carlos Sinogas, Luís Alho, Isabel Brito, 1998


SUMÁRIO

 

OBJECTIVO *

CULTURA DE BACTÉRIAS em meio líquido *

Preparação de meios Sólidos *

Extracção e Purificação de DNAs *

MINIPREPARAÇÃO DE DNA PLASMÍDICO *

quantificação de DNAs *

RESTRIÇÃO Enzimática *

Separação Electroforética *

purificação de fragmentos de DNA (agarose "low melting") *

Material Biológico *

pCS11 * / pCS62 * / pCS71 * / pCS84 * / pSK+ *

Notas *

 

OBJECTIVO

 

Material Biológico

Bactérias transformadas com plasmídio vector (pSK+) e com plasmídios recombinantes (pCS11, pCS62, pCS71, pCS84)

CULTURA DE BACTÉRIAS em meio líquido

Reagentes

LB 10X:

Bacto-triptona 100 g

Extracto de levedura 50 g

NaCl 100 g

H2O destilada até 1000 ml

pH 7,5. Autoclavar. Conservar estéril a 4C.

Ampicilina 1000X:

50 mg/ml em água. Esterilizar por filtração, conservar a -20C.

Água destilada e esterilizada

 

Protocolo Experimental

Preparação de meios Sólidos

Reagentes

LB 10X

Ampicilina 1000X

Água destilada e esterilizada

Agar agar (Difco 80-120 Mesh)

Protocolo Experimental

Agar 2X

Agar - LB/amp

Placas de Petri

Tubos para Stabs

 

Extracção e Purificação de DNAs

Reagentes

LB 1X com ampicilina.

Lisozima (pó)

Isopropanol

5 M NaCl

Etanol puro e 70 %

TE pH 8,0:

Pronase 20 mg/ml em água (auto-digerida durante 2 horas a 37C. Conservar a -20C)

Pronase Mix:

RNAse A 10 mg/ml em:

RNAse mix:

Solução I:

Solução II:

Solução III:

Fenol:clorofórmio:

 

Protocolo Experimental

(50 g/ml = 1 UDO)

 

MINIPREPARAÇÃO DE DNA PLASMÍDICO

 

Reagentes

(mesmos da Preparação de DNA Plasmídico)

 

Protocolo Experimental

Quantificação de DNAs

 

Reagentes

Solução padrão de DNA (0,5 mg /ml)

Solução de DNA a quantificar

Parafilm

TE/BrEt: TE pH 8.0 contendo Brometo de etídio a 0,5 g/ml

 

Protocolo Experimental

Tubo

TE/BrEt

DNA

Concentração

Amostra

Volume

1

45 l

Padrão

5 l

50 g / ml

2

45 l

Tubo 1

5 l

5 g / ml

3

45 l

Tubo 2

5 l

500 ng / ml

4

45 l

Tubo 3

5 l

50 ng / ml

5

45 l

Tubo 4

5 l

5 ng / ml

6

50 l

-

-

0

RESTRIÇÃO Enzimática

 

Reagentes

Solução de DNA a analisar

Enzimas de restrição:

Fenol:clorofórmio

Tampão Universal (Stratagene) 10X (TUS 10X):

 

Protocolo Experimental

 

Separação Electroforética

 

Reagentes

TBE 10X

Agarose média ou baixa EEO (Sigma Tipo II ou V)

Brometo de etídio 10 mg/ml

Dye-DNAs (Indicador de Migração):

DNA marcador:

 

Protocolo Experimental

 

Purificação de fragmentos de DNA (agarose "low melting")

 

Reagentes

Fragmento de DNA a purificar

Fenol:clorofórmio

Lâmina de barbear, passada por álcool

TAE 10X

 

Protocolo Experimental

Material Biológico

pCS11

 

pCS62

pCS71

 

pCS84

 

pSK+

 

 


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Actualização: Junho, 2000